VS2008です
実行後の画面に差異が生じます。

１．デザイン画面ではCSSが適用された見た目になります。
２．デバッグ実行のブラウザではCSSが適用されない見た目になります。
３．ブラウザでIISを通してみるとCSSが適用された見た目になります。

デバッグ実行（仮想サーバ？）ではCSSは適用されないのでしょうか？

aspxファイル、cssファイルは同一のディレクトリにあり、パスの間違いではなさそうです。